其原理是在(zai)末端脫氧(yang)核糖(tang)核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的(de)(de)作用下，在(zai)基因組(zu)DNA斷(duan)裂時暴露出的(de)(de)3′-羥基（3′-OH）末端摻入生(sheng)物(wu)(wu)素(su)（Biotin）標志的(de)(de)dUTP，隨后通過Biotin與連接辣根過氧(yang)化酶的(de)(de)鏈霉親和素(su)（Streptavidin-HRP）特異結合(he)，在(zai)辣根過氧(yang)化酶底物(wu)(wu)二氨基聯苯胺（DAB）的(de)(de)存在(zai)下，產生(sheng)深棕色的(de)(de)不溶物(wu)(wu)，從而特異準確地定位(wei)凋亡(wang)的(de)(de)細胞。

本試劑盒可用于石蠟切片、冰凍切片和細胞樣本（細胞涂片或爬片）的凋亡原位檢測，檢測結果可在普通光學顯微鏡下直接觀察計數。
包裝清單：

產品組成：

保存條件：

Streptavidin-HRP, 4℃, 其余試(shi)劑-20 ℃保存，一年有效。

操作(zuo)步驟：

1、樣本處理：

a) 石蠟切片：經二甲(jia)笨、酒精(jing)脫(tuo)蠟，復水。脫(tuo)蠟應充分(fen)。

b) 冰(bing)凍(dong)切片(pian)：流水沖洗(xi)，去除OCT包埋(mai)膠(jiao)后，用純水洗(xi)3次。

c) 細(xi)胞飛片(pian)：用組織固(gu)定(ding)液固(gu)定(ding)后，用PBS洗(xi)三次，每(mei)次5分鐘(zhong)。1% Triton X-100處理10分鐘(zhong)，用PBS洗(xi)三次，每(mei)次5分鐘(zhong)。

2、蛋白酶消化

將1ul 試劑（A）50× Proteinase K稀釋于50ul PBS中，滴加到組織上，37℃孵育10-20分(fen)鐘。消化結束(shu)后，用(yong)PBS洗三次，每次5分(fen)鐘。

3、封閉

用3%的雙氧水（H2O2）室溫封閉(bi)10分(fen)鐘，封閉(bi)結束后用PBS洗三次，每次5分(fen)鐘。

4、陽性對照組織的處理

將組織用DNase I消(xiao)化，以(yi)獲得斷裂(lie)的DNA，即成Tunel染色陽(yang)性的對照。陽(yang)性對照組織也可以(yi)選(xuan)用小(xiao)鼠的小(xiao)腸組織切(qie)片。

將50 ul DNase I消化液滴加于組織上，37℃孵育10-30分鐘，消化結束后，用PBS洗三次，每次5分鐘。

5、連接:

連(lian)接(jie)反應前用50 ul Equilibration Buffer孵育(yu)標(biao)本5-10分(fen)鐘(zhong)。孵育(yu)過程(cheng)中按下表配制連(lian)接(jie)工(gong)作(zuo)液。去除標(biao)本上(shang)的Equilibration Buffer后(hou)，直接(jie)滴(di)加(jia)50ul 連(lian)接(jie)工(gong)作(zuo)液，37℃孵育(yu)1-2小時，染(ran)色結束后(hou)，用PBS洗(xi)三次，每次5分(fen)鐘(zhong)。

6、標志

取1 ul 試劑（I）Streptavidin-HRP加入到50ul PBS 中，混勻后滴加至組織上，37℃避光孵育30分鐘，隨后用PBS洗三次，每次5分鐘。

7、顯色

取50 ul 試(shi)劑(ji)（J）DAB-A solution 與2.5 ul 試(shi)劑(ji)（K）DAB-B solution混勻后(hou)，滴(di)加至組織上，室(shi)溫顯(xian)色反應30秒(miao)至5分(fen)鐘。顯(xian)色結(jie)束(shu)后(hou)，用(yong)PBS洗三次(ci)，每(mei)次(ci)5分(fen)鐘

8、蘇木素復染

每組織上(shang)滴(di)加數滴(di)Mayer’s蘇(su)木(mu)素染(ran)色(se)液，染(ran)色(se)1-5分鐘(zhong)，隨后(hou)用(yong)(yong)自來(lai)水沖(chong)洗反(fan)藍，如蘇(su)木(mu)素染(ran)色(se)過深(shen)，可用(yong)(yong)1%鹽酸酒精溶液分化數秒，再(zai)次(ci)反(fan)藍；如蘇(su)木(mu)素染(ran)色(se)過淺，可用(yong)(yong)蘇(su)木(mu)素再(zai)次(ci)染(ran)色(se)，并(bing)延長染(ran)色(se)時(shi)間。

9、封片觀察

經梯(ti)度酒精脫水(shui)，二甲苯透明后，滴加中性樹膠，加蓋玻片封(feng)片，光(guang)學顯微鏡下觀察拍照。

注(zhu)意事項(xiang)：

1、Proteinase K 消化(hua)時間需要摸索，冰凍切(qie)片 10 min 左右，石(shi)蠟切(qie)片時間應適(shi)當延長。

2、陰性對(dui)照體(ti)系：配制連接工作液時用純水(shui)替代TdT Enzyme。

3、連接與(yu)標志反應時應注(zhu)意避光。

4、實驗過程中請穿戴手套、實驗服等，做好個人防護。

備注：

         產品信息可能會有優(you)化升級，請以(yi)實(shi)際標(biao)簽(qian)信息為(wei)準。

本產品(pin)僅供科研使用。請(qing)勿用于(yu)醫藥、臨床診(zhen)斷(duan)或治療，食品(pin)及化妝品(pin)等用途。請(qing)勿存(cun)放于(yu)普通住(zhu)宅區(qu)。

為(wei)了您的安全和健康，請在實驗過程中做好防護(hu)工作。