其原理(li)是在末端脫氧(yang)核糖核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的(de)作用下，在基(ji)(ji)因組(zu)DNA斷裂時暴露出的(de)3′-羥(qian)基(ji)(ji)（3′-OH）末端摻入被(bei)Alexa Fluor 488染料(liao)標(biao)(biao)志的(de)dUTP，使凋(diao)亡的(de)細胞(bao)被(bei)標(biao)(biao)志上(shang)綠色熒(ying)光，從而可以(yi)用熒(ying)光顯(xian)微鏡或流式細胞(bao)儀檢測。

本試劑盒為直接熒光標志法的TUNEL染色，染色步驟簡便，應用范圍廣泛，可用于檢測冰凍切片、石蠟切片和培養細胞的凋亡情況。
包裝清單：

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒產品組成：

保(bao)存(cun)條件：

-20 ℃保存(cun)，一年(nian)有效(xiao)。

操作步驟：

1、樣本(ben)處理：

a) 石蠟(la)(la)(la)切片：經二甲笨、酒精脫蠟(la)(la)(la)，復水。脫蠟(la)(la)(la)應充(chong)分。

b) 冰凍切片：流(liu)水(shui)沖(chong)洗，去除OCT包埋膠后，用純水(shui)洗3次。

c) 細(xi)胞飛片：用組(zu)織固(gu)定(ding)液固(gu)定(ding)后，用PBS洗三(san)次，每(mei)次5分鐘。1% Triton X-100處理10分鐘，用PBS洗三(san)次，每(mei)次5分鐘。

2、蛋白酶消(xiao)化

將1ul 試劑(ji)（A）50× Proteinase K稀釋于(yu)50ul PBS中(zhong)，滴加到(dao)組織上，37℃孵育10-20分鐘(zhong)。消化結束后，用PBS洗(xi)三次，每次5分鐘(zhong)。

3、陽性對照組(zu)織的處理

將(jiang)組織用(yong)DNase I消化，以獲得斷裂的DNA，即成Tunel染色陽性(xing)的對照。陽性(xing)對照組織也可以選(xuan)用(yong)小鼠的小腸組織切片。

將(jiang)50 ul DNase I消化液滴加于(yu)組織上，37℃孵育10-30分(fen)鐘，消化結(jie)束后，用PBS洗三次，每(mei)次5分(fen)鐘。

4、Tunel標(biao)志染色:

Tunel標志染(ran)(ran)色前用(yong)50 ul Equilibration Buffer孵育(yu)標本(ben)(ben)5-10分鐘(zhong)。孵育(yu)過程中按下表配制Tunel染(ran)(ran)色工作(zuo)液。去(qu)除(chu)標本(ben)(ben)上的Equilibration Buffer后(hou)，直(zhi)接滴(di)加50ul Tunel染(ran)(ran)色液，37℃孵育(yu)1-2小時，染(ran)(ran)色結束(shu)后(hou)，用(yong)PBS洗三次(ci)，每(mei)次(ci)5分鐘(zhong)。

5、封片：

每組織(zhi)上滴加一滴封劑(ji)(ji)，小心(xin)蓋(gai)上蓋(gai)玻片(pian)，避免產生(sheng)氣泡(pao)。用(yong)吸水紙吸去多余的封片(pian)劑(ji)(ji)。熒光顯微鏡下觀察。

注意事(shi)項(xiang)：

1、Proteinase K 消化時(shi)間需要(yao)摸索(suo)，冰凍切(qie)片 10 min 左(zuo)右，石(shi)蠟切(qie)片時(shi)間應(ying)適當延長。

2、陰性對照體系：配制Tunel染色工(gong)作(zuo)液時(shi)用純水替代TdT Enzyme。

3、懸浮細胞用離心的方法(fa)收(shou)集細胞，所有反應(ying)在離心管中(zhong)進行，染(ran)色結(jie)束后，可在熒光顯微下(xia)觀察，也(ye)可以用流式細胞儀(yi)檢(jian)測。

4、Tunel標志(zhi)染(ran)色(se)時應注意(yi)避(bi)光。

5、實驗(yan)過程(cheng)中請穿(chuan)戴手套、實驗(yan)服(fu)等，做好個(ge)人(ren)防護(hu)。